Enzymatyczną ELISA immunologicznych


Test immunoenzymatyczny (ELISA) - Współczesne badania laboratoryjne, w której wyszukiwane i antygeny swoiste przeciwciała we krwi do konkretnych chorób, określenie nie tylko etiologii, lecz także od stadium choroby. Wyniki testu ELISA może wydawać się jakościowo i ilościowo.

Obecnie ELISA stosuje się w następujących sytuacjach:

1) Szukaj przeciwciałami specyficznymi dla każdej choroby zakaźnej;
2) antygeny wyszukiwania chorób zakaźnych (weneryczne);
3) badanie stanu hormonalnego pacjenta;


4) badania dla markerów nowotworowych;
5) badanie na obecność chorób autoimmunologicznych.

Zalety metody ELISA:

1) wysoka czułość i swoistość testu ELISA (ponad 90%).
2) Zdolność do określenia i śledzenie dynamiki procesu chorobowego, tj porównanie liczby przeciwciał w różnych odstępach czasowych.
3) dostępność ELISA diagnostyki w jakiejkolwiek placówce medycznej.

Względny brak:

1) Detekcja odpowiedzi immunologicznej (przeciwciał), ale nie jest z patogenu.

Podstawowe pojęcia

Przed wyjaśnić istotę metody ELISA, krótko zrozumieć niektóre pojęcia.

Przeciwciała lub immunoglobuliny (Ig) - - Specyficzne białka wytwarzane przez B -
limfocyty (komórki odpornościowe) w odpowiedzi na trafienie w organizmie patogenów zakaźnych (wirusy, bakterie, grzyby, itp). Nie immunoglobuliny A (IgA), immunoglobuliny E (IgE), immunoglobulina M (IgM), immunoglobuliny G (IgG), immunoglobuliny D (IgD). Różnią się od siebie i tworzą masę cząsteczkową, okres półtrwania, udział / non-udziału w procesie zakaźnej czas wykrycia po zakażeniu. Jeśli weźmiemy pod uwagę masę cząsteczkową, najbardziej he IgM - to pentamer (950 000 daltonów), w przeciwieństwie do innych Ig (od 150 do 200 000 Tak), więc IgM po prostu nie może przejść przez barierę łożyskową. Dlatego wykrywanie przeciwciał IgM w dziecięcej 1 roku życia jest zawsze oznaką zakażenia płodu. W surowicy immunoglobuliny reprezentował większość to IgG (75-85%), a najniższy - IgE (0,003%). W procesie zakaźnych tylko brały bezpośredniego udziału IgA, M, G. IgE jest znakiem reakcji alergicznych i chorób, i IgD - można znaleźć tylko w węzłach chłonnych i migdałków tkanki, odgrywa rolę w kształtowaniu odporności lokalnej.

Do klas immunoglobulin

Antygeny - Wielkocząsteczkowe substancje pochodzenia organicznego, w tym chorób zakaźnych i innych, jak również różne substancje zmienione komórki utworzone za pomocą jednego lub innej choroby (chorób autoimmunologicznych, onkologia).

Kompleks immunologiczny - Kompleks antygen-przeciwciało, które są zaangażowane w proces immunologiczny.

Jaka metoda oparta ELISA.

Istnieje kilka odmian ELISA (bezpośrednie, pośrednie metody blokowania, konkurencyjnego), ale w praktyce często używane heterogenicznego w fazie stałej analizę immunologiczną albo ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny)

Podstawa ELISA odpowiedź odpornościowa jest antygenem i przeciwciałami w celu utworzenia kompleksu immunologicznego: antygen-przeciwciało, powodując zmiany w aktywności enzymatycznej poszczególnych etykiet na powierzchni przeciwciała.

Metoda IFA

W prosty sposób, proces ten może być podzielony na kilka etapów:

1) otwory powierzchni tabletu lekarz egzaminator jest oczyszczony antygen specyficzny patogen. Przez dodanie materiału (surowica krwi) biologicznego pacjenta specyficzne reakcja pomiędzy antygenem i pożądanego przeciwciała (immunoglobuliny). Takie połączenie będzie działał jako "szczególny antygen" w następnym etapie.

2) W tym etapie tworzenie IR (kompleksów immunologicznych), - reakcja pomiędzy "określonego antygen" i koniugatu (nie immunoglobuliny znakowane enzymem peroksydazą). Specjalne chromogenowy dodaje. Wynikiem tej reakcji enzymatycznej jest powstawanie zabarwionych substancji z otworu w tabletce intensywność koloru zależy od ilości zawartego w materiale pacjentów immunoglobuliny (przeciwciała).

3) Następnie, wynik ogólny: fotometryrovanye stosując spektrofotometr wielokanałowego w porównaniu do gęstości optycznej badanej istotnych testów kontrolnych gęstość optyczna matematyczne przetwarzania wyników. Ilość przeciwciał u pacjenta zależy od wysokości gęstość optyczną studzienek.

Zwykle w praktyce, z użyciem 96-studzienkowych płytkach.

Gdy pomiar gęstości optycznej (OP) zlicza cieczy testowej (lub stężenia) przeciwciała w określonej objętości urządzenia. Wyniki są porównywane z próbką kontrolną.

Należy pamiętać:dla każdego systemu testowego opracowane indywidualne wskaźniki wyników rachunkowości, norm wydajności i patologii (czyli "wartość odniesienia"). Należy to uwzględnić przy ocenie wyników poszczególnych badań. Błędnie interpretować wyniki jednego laboratorium na "wartości odniesienia" innym laboratorium. Nieprawidłowe także porównanie wyników różnych laboratoriach siebie.

Podczas ustawiania reakcji ELISA i ważnych pojęć, takich jak zachłanności przeciwciał.
Przeciwciała zachłanności - Jest to siła wiązania z antygenem i przeciwciałem i ilości antygenu, która jest w połączeniu z immnohlobulinami (przeciwciała). Awidność jest ważny dla oceny przewidywany czas infekcji, które jest bardzo ważne w diagnostyce zakażenia pierwotnego u kobiet w ciąży.

Podstawą testu na zachłanność przeciwciała obejmuje przetwarzanie kompleksów immunologicznych (antygen-przeciwciało) roztworu mocznika zniszczyć białka. Połączenie Vysokoavidni pozostać nienaruszone i nyzkoavidnyh zniszczone. Wynik podawany jest w formie wskaźnika zachłanność, wyrażone w procentach (%).

Co choroby są wykrywane przez ELISA diagnostyki?

1. Infekcje
1,1 Wirusowe zapalenie wątroby (IgM, G), B, antygeny -HBsAg pacjentów HBeAg przeciwciało - HBcorAg IgM, IgG, IgG całkowitej HBcorAg HBeAg), C (przeciwciała Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G) i inne.
1.2 zakażenie HIV (IgG)
1.3 Tsytomehalovyrusnaya infekcji (przeciwciała IgM, G)
1,4 Epstein-Barr virus infekcji lub mononkleoz (przeciwciało IgM, G EA VCA białka NA wirusa)
(1,5 opryszczkowe zakażenie Przeciwciała IgM, G)
1,6 Toxoplasmosis (przeciwciało IgM, G)
1.7 różyczki (IgM, G)

1.8 Odra (IgM, G), brucelozy (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonellezom (IgM, G), Shyhellez lub czerwonka (IgM, G), aspergiloza (IgM, G), kleszczowe zapalenie mózgu i boreliozy wiele innych.
1.9 pasożytniczą (giardiasis, toksokarozy, włośnica, przywr, bąblowicy, alveokokkoz i inne), w których wykryto IgG
1.10 STD (choroby przenoszone drogą płciową) - mykoplazmozy (IgM, G), ureaplasmosis (IgM, G), Chlamydia (IgA, M, G), kiła (IgG)
1,11 pylori (IgG)

2. markery chorób autoimmunologicznych i ludzki parametry immunologiczne (całkowita IgE, całkowitej IgG, całkowitej IgA, całkowitej IgM, całkowitej IgD, wydzielnicze IgA, IgG 2, IgG4, CEC krążących kompleksów immunologicznych, IgA i IgG gliadynę, etc.)

3. markery Onkolohichsekie (TNF - czynnik martwicy nowotworów, CEA - antygen rakowo, PSA - antygenu hCG prostatspetsyfichnyy - ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, CA 125, alveomutsin i wiele innych)

4. Zaburzenia układu rozrodczego (estradiol, progesteron, prolaktyna, testosteron, AFP- alfafetoproteyn, FSH - hormon folikulotropowy i inne)

5. tarczycy (wolna i związana T3 T4, tyreoglobuliny, tireoperoksidaze - TPO, TSH - TSH).

Ta lista jest przedstawiony nie wszystkie choroby są diagnozowane za pomocą testu ELISA.

Materiał do analizy i zasad ogrodzenia ELISA

Najczęściej stosowanym materiałem do reakcji ELISA - surowicy krwi pacjenta, pobranej na czczo. Materiał może również służyć jako płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn owodniowy, ciała szklistego śluzu szyjki macicy, treści wymazów z cewki moczowej i.

Przygotowanie pacjentów do dostarczania materiału do testu ELISA

Krew pobrano na czczo. Zanim jakakolwiek krew nie musi przyjmować żadnych leków. Określone leczenie (antybakteryjne, przeciwwirusowe, protyvoparazytarnoe) powinien zatrzymać co najmniej 2 tygodnie przed badaniem.

Warunki IFA produkcji

Materiał jest szybkie immunologicznych enzymatyczny, z dnia na dzień. Opóźnienia mogą być w różnych laboratoriach z uwagi na nagromadzenie wielu surowic.

Możliwe wyniki ELISA diagnostyki

Oceniając wyniki do określonych przeciwciał klasy infekcji ważne, a ich liczba. Na zależy nie tylko etiologię infekcji (lub jego braku), ale również do przewidzenia stadium choroby (ostre, przewlekłe), a obecność aktywnego zakażenia (ostre lub zaostrzenia przewlekłej) w czasie badania.

Jakie są przybliżone terminy pojawienia się przeciwciał (immunoglobulin - Ig)?

Najwcześniejsze przeciwciała IgM. Zidentyfikować można je 1-3 tygodni po ewentualnym infekcji, charakteryzującą ostrej fazy zakażenia. Druga sytuacja jest pojawienie się przeciwciał IgM - włączenia (lub pogorszenie) przewlekłego procesu. Przeciwciała IgM krążą przeciętnie o około 3 miesiące, po czym ich liczba stopniowo zanika. Jednakże, u niektórych pacjentów może nastąpić w ciągu 1-2h lat zakażenia Śladowe ilości IgM.

Nowoczesne systemy testowe z wysoką czułością, w wyniku fałszywie dodatnich wyników są niespecyficzne (często u kobiet w ciąży). Dlatego w tej grupie pacjentów, dodatnie IgM powinna być testowany!

Przeciwciała klasy IgA pojawiają 2-4 tygodni po infekcji, ale w ilości wystarczającej do identyfikacji - miesiąc. Serum IgA syntetyzowane przez komórki plazmatyczne śledziony, węzłów chłonnych i błon śluzowych, wydzielnicze IgA skupionych w błonach śluzowych do wykonywania jego funkcji ochronnej - udział w miejscowej odporności.

Od 4 tygodni po zakażeniu zaczynają pojawiać się przeciwciała IgG. W większości zakażeń miano stopniowo zwiększa się od wartości maksymalnej w różnych czasach (średnio 1,5-2 miesięcy), a miano pozostaje na niskim poziomie i wskazuje na układ odpornościowy. W niektórych chorobach (mikoplazmozy, chlamydia, rzęsistkowica) Poziom IgG nie jest wysoki, ponieważ znacznie zmniejsza się z powodu braku odporności na tych zakażeń.

Opcje dla wykrywania przeciwciał różnych klas:

- Isolated wykrywania przeciwciał IgM zakłada, że ​​głównym

zakażenia.
- Jednoczesne wykrywanie IgM i IgG we krwi typowe dla zakażenia pierwotnego
w ciągu 2-3 miesięcy, jak również zaostrzenia przewlekłej choroby. Tak więc, obecność przeciwciał IgM w ciąży nie zawsze jest objawem zakażenia pierwotnego.
- Identyfikacja pojedyncze IgG może wskazywać jak odporność na choroby,
i przewlekłe infekcje. W drugim przypadku jest ważne, a ilość przeciwciała (miano) i zmiany dynamiki ilości. Typowo, badania przeprowadzone w odstępach 2-4-6 tygodni.

- Wykrywanie IgA lub IgM wskazuje infekcji pierwotnej izolacji. W
Pojawienie IgA IgG oczekuje aktywację przewlekłego zakażenia (średnio 2 tygodnie od daty zaostrzenia).

Oznaczanie zachłanności przeciwciał IgG jest doskonałym uzupełnieniem etapem rozpoznania pierwotnego zakażenia od starego infekcji, która ma swoje znaczenie kliniczne, zwłaszcza w ocenie ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego płodu. Wykrywanie IgG nyzkoavidnyh oznacza zakażenie pierwotne i są średnio 4-6 miesięcy po zakażeniu, rzadziej dłuższe. Nyzkoavidnyh IgG wymagają inne dowody laboratoryjne zakażenia pierwotnego (IgM). Vysokoavidni przeciwciała jest albo oznaką przewlekłej choroby i jej zaostrzenie lub wytwarzać odporność.

Funkcje niemowląt:dzieci do roku, a czasem 1,5 roku w matczynej krwi krążącej IgG na infekcje (to był ich przenikania przez łożysko od matki na płód w macicy). To nie jest samo w sobie znakiem infekcji obecnie. Jeśli wiek takjm są IgM (IgM przypomnieć, że matki przenikają przez łożysko nie może), to jest to oznaką infekcji lub zakażenia płodu nabyte po urodzeniu.

Ilościowa metoda ELISA

Wynik diagnostyki za pomocą analizatora ELISA (ELISA) pojawia się w niektórych jednostkach:
- Gęstość optyczną (OP) próbka - stężenie swoistych przeciwciał w jednostce objętości. Wyższe próbki OP wyższe stężenie przeciwciała. Niektóre wyniki odnoszą się do proporcji dodatniej (CP) - jest również gęstość optyczną próbki.
- Jednostki stężenia przeciwciał (nanohramm / mililitr, ng / ml).
- Za miano surowicy: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200 i tak dalej. Miana diagnostyczne (w których choroba jest zdiagnozowana, a nie fakt, zakażenia) dla różnych chorób są różne.

- W postaci symboli - "+", "-", (+, ++, +++, ++++) "?".
- W jakościowej oceny danego kryterium (pozytywnej lub negatywnej).

Prawidłowo oszacować ilość wykrywania przeciwciał klasy IgG opcji, a więc ustawić stadium choroby i konieczności leczenia może jedynie lekarz.

Nie wolno nam zapominać, że dla każdego systemu badawczego opracowanego przez ich "wartości odniesienia" (warianty), zasad, które i powyżej określonego rozpoznaniem choroby (opcji patologii). Dla różnych systemów testowych "wartości odniesienia" są różne.

Prawidłowe porównujące wyniki IFA, podjęte w dynamice, możliwe tylko w przypadku produkcji w tym samym laboratorium.